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武
Shandong Lvdu Bio-Sciences&Technology Co.,Ltd.
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一、生產定量
1．生產材料
1.1 包被液
1.2 磷酸鹽緩沖液
1.3 標準品稀釋液
1.4 樣品稀釋液
1.5 封閉液
1.6 抗體稀釋液A1
1.7 酶稀釋液E1/E2
1.8 洗滌液
1.9 底物液A液
1.10 底物液B液
1.11 終止液
2．使用儀器設備
2.1 冰箱
2.2 生化培養箱
2.3 洗板機
2.4 酶標儀
2.5 渦旋儀
2.6 天平（感量0.01）
2.7 氮吹儀
3．EL1SA檢測方法的建立
3.1 多因素正交試驗（抗原*包被濃度及抗體工作濃度的確定）
在ELISA實驗中必須首先對抗原的*包被濃度以及抗體的工作濃度予以選擇，從而達到抗原抗體二者之間的*反應條件。ELISA實驗中通常采用正交試驗來對二者之間的*反應條件進行確定（實驗設計如表2.1）。
表2.1 ELISA加樣示意表
| 抗體稀 釋倍數 | 抗原稀釋倍數 | |||||
| 1 : 10 000 | 1 : 20 000 | 1 : 40 000 | 1 : 80 000 | 1 : 160 000 | 1 : 320 000 | |
| 1:10000 | | | | | | |
| 1:20000 | | | | | | |
| 1:40000 | | | | | | |
| 1:80000 | | | | | | |
| 1:160000 | | | | | | |
| 1:320000 | | | | | | |
具體操作步驟如下：
① 包被：將包被抗原用包被緩沖液做系列稀釋，每孔取100 mL加入酶標板，包被條件如下：
| 包被溫度 （℃） | 包被時間 （hour） | |||||
| □ 4℃ | □ 27℃ | □ 37℃ | □ 2 h | □3 h | □18h | □24h |
② 洗板：甩去孔內液體，用洗板機洗滌微孔2次（或每孔加入250 mL洗滌緩沖液洗滌），每次靜置10 s，zui后一次使板盡量甩干并在吸水紙上拍干；
③ 封閉：每孔加入180 mL封閉液，37 ℃放置1.5 h；甩去孔內液體，不經洗滌直接在吸水紙上拍干；
④ 烘干：采取再次烘干或者晾干的方式*干燥酶標板。烘干：37 ℃倒置（不加蓋板膜或用自封袋），每5塊板烘干30 min，隨著板子數量增多時間相應延長，如100塊板，需要烘3 h，一次類推；晾干：底部鋪一層干凈的A4紙或者吸水紙，倒置板子，在頂層鋪一層蓋住避光，室溫晾18-24h。
⑤ 正交試驗：根據不同的檢測物質采用一步法或兩步法進行實驗。
（1）一步法操作步驟：
取出所需的不同包被濃度的板條，按照設計的對應孔每孔依次加入50 mL 包被液（零標準）、50 mL 1000倍稀釋的HRP酶標物、50 mL系列稀釋的抗體，孵育條件如下：
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時間 （min） | ||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □ 20 min | □30 min |
洗板：甩去孔內液體，每孔加入250 mL洗滌緩沖液，靜置20 s后，再次甩去孔內液體。重復洗滌微孔3次，zui后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干；
底物：加入底物A 50 mL /孔和底物B 50 mL /孔，孵育條件如下表：
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時間 （min） | |||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □10 min | □15 min | □20 min |
終止：每孔加入50 mL 終止液；
讀數：用酶標儀在雙波長450 / 630 nm測定每孔OD值，分析軟件分析數據。
（2）兩步法操作步驟：
取出所需的不同包被濃度的板條，按照設計的對應孔每孔加入50 mL 包被液（零標準）和50 mL系列稀釋的抗體，孵育條件如下：
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時間 （min） | ||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □ 20 min | □30 min |
洗板：甩去孔內液體，每孔加入250 mL洗滌緩沖液，靜置20 s后，再次甩去孔內液體。重復洗滌微孔3次，zui后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干；
酶標物：每孔加入100 mL 1000倍稀釋的HRP酶標物，孵育條件如下；
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時間 （min） | |||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □15 min | □20 min | □30 min |
底物：加入底物A 50 mL /孔和底物B 50 mL /孔，孵育條件如下表：
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時間 （min） | |||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □10 min | □15 min | □20 min |
終止：每孔加入50 mL 終止液；
讀數：用酶標儀在雙波長450 / 630 nm測定每孔OD值，分析軟件分析數據。
針對上述結果，選擇OD值在2.200 - 2.500范圍內所對應的抗原、抗體稀釋倍數，然后根據此條件下建立的標準曲線及IC50值等條件，進一步確定包被抗原和抗體的工作濃度。
3.2 酶標免疫測定程序（標準曲線工作條件的選擇）
（1）一步法操作步驟：
選擇抗原合適包被濃度的板條，按照設計的對應孔每孔依次加入50 mL 標準品/樣品、50 mL 1000倍稀釋的HRP酶標物、50 mL合適濃度的抗體，孵育條件如下：
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時間 （min） | ||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □ 20 min | □30 min |
洗板：甩去孔內液體，每孔加入250 mL洗滌緩沖液，靜置20 s后，再次甩去孔內液體。重復洗滌微孔3次，zui后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干；
底物：加入底物A 50 mL /孔和底物B 50 mL /孔，孵育條件如下表：
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時間 （min） | |||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □10 min | □15 min | □20 min |
終止：每孔加入50 mL 終止液；
讀數：用酶標儀在雙波長450 / 630 nm測定每孔OD值，分析軟件分析數據。
（2）兩步法操作步驟：
選擇抗原合適包被濃度的板條，按照設計的對應孔每孔加入50 mL標準品/樣品和50 mL合適濃度的抗體，孵育條件如下：
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時間 （min） | ||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □ 20 min | □30 min |
洗板：甩去孔內液體，每孔加入250 mL洗滌緩沖液，靜置20 s后，再次甩去孔內液體。重復洗滌微孔3次，zui后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干；
酶標物：每孔加入100 mL 1000倍稀釋的HRP酶標物，孵育條件如下；
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時間 （min） | |||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □15 min | □20 min | □30 min |
底物：加入底物A 50 mL /孔和底物B 50 mL /孔，孵育條件如下表：
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時間 （min） | |||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □10 min | □15 min | □20 min |
終止：每孔加入50 mL 終止液；
讀數：用酶標儀在雙波長450 / 630 nm測定每孔OD值，分析軟件分析數據。
針對不同條件下產生的標準曲線，選擇能夠滿足要求的抗原抗體工作濃度。曲線要求零標準的OD值在2.200 - 2.500范圍內，線性要求大于0.99，B點結合率介于75%-90%之間，拐點≤2；IC50介于中間標準品內。
3.3注意事項
3.1 將所需試劑從冷藏環境中取出，待其*回升至室溫（20～25 ℃）后方可使用。注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
3.2 洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3.3 反應終止液為硫酸，避免接觸皮膚。
3.4 生產定量標準
3.4.1 溶液配置體積按照入庫數量配置，避免浪費；
3.4.2 零標準的OD值入庫時控制在2.200-2.500；
3.4.3 標準曲線線性要求大于0.99；
3.4.4 標準曲線的拐點≤2；
3.4.5 IC50值介于中間標準品內；
3.4.6 B點結合率介于75%-90%之間。
3.5 生產定量要求
3.5.1 入庫分裝用的試劑配制好后，避免直接使用原瓶試劑，特別是需要多次使用的溶液，應分裝出需要體積兩倍的溶液單獨使用，避免分裝用原瓶試劑污染。
3.5.2 配置酶標物的試劑瓶應采用滅菌過的試劑瓶，其余試劑組分不需要采用滅菌試劑瓶。
3.5.3 配置用溶液無論體積多少，使用前均需檢查外觀是否渾濁或污染，然后再配制半成品溶液。
3.5.4 每生產一批及時填寫生產定量批記錄表（如下表），由生產部負責備檔以便后期追蹤審查。
一、 生產檢驗
1．指標要求
食品安全ELISA試劑盒入庫前需滿足的指標要求如下：
1.1 零標準的OD值入庫時控制在2.200-2.500；
1. 2 標準曲線線性要求大于0.99、拐點≤2 、B點結合率介于75%-90%之間；
1. 3 IC50值介于中間標準品內；
1.4 陰性樣本背景值≤檢測限；
1.5 加標回收率介于70%-130%之間。
2. 檢驗
2.1生產定量后由生產負責人按照規定的檢驗指標進行*次檢驗，并填寫試劑盒入庫檢驗報告單，各指標符合要求后轉交質控負責人進行復核檢驗，并填寫試劑盒入庫檢驗報告單（如下表）。
2.2 質控合格的由質控負責人簽字生產檢驗單，告知生產部門及時入庫。
2.3 生產檢驗單由質控負責人負責備檔以便后期追蹤審查。
二、 產品包裝
1. 生產部按照要求將檢驗合格的產品及時分裝入庫，各試劑核對無誤，方可分裝；分裝時要求環境潔凈，分裝人需帶一次性口罩，分裝不同液體使要及時更換槍頭并且要慢吸防止倒吸，造成交叉污染。
2. 及時填好生產包裝批記錄表（如下表），由生產部負責備檔以便后期追蹤審查。
四、產品質控
1. 半成品管理
1.1 半成品要妥善保存，注明名稱，日期，負責人名字，再次使用前檢查外觀是否渾濁或污染，確認無誤后方可使用。
1.2 對放置超過3個月的以及外觀不正常的試劑及時清理。
2. 成品管理
2.1 試劑盒分裝后，留出一盒48T放置留樣庫，其余放置成品庫。
2.2 由質控負責人按照入庫時間計時，隔半月、1.5月、3月、6月及時進行質控，查看標準曲線情況，并填寫檢測試劑盒質控明細表（如下表），對不符合要求的試劑盒及時通知生產部門解決。
2.3 庫存超過三個月的試劑盒根據質控情況更換批次或者更換關鍵試劑，重新入庫，由生產部負責管理，對整改入庫的試劑盒及時填寫整頓單，由生產部負責備檔以便后期追蹤審查。
2.4質控報告模板統一，每批次試劑盒的質控曲線，一定注明單位（一般為ppb），采用清晰的截圖方式，例如下圖所示。
2.5 每個試劑盒均附有一份質控報告，質控報告由質控負責人簽字后方可裝入試劑盒。
五、發貨管理
1. 報單記錄
銷售人員在明確客戶名稱、地址、產品、規格、單價、數量等信息后，及時記錄報貨明細，核對明細后詳盡地填制到《發貨申請單》上；然后通過、傳真、網絡等方式報單至相應部門負責人。
2. 銷售合同
根據客戶需求制作銷售合同（如下圖），雙方達成一致后，待客戶按照賬戶匯款成功后，試劑盒發貨相應部門進行備貨、制單、發貨。
3. 制單
相關部門根據《發貨申請單》，編制《發貨單》。“發貨單”為五聯單，即存根聯、記賬聯、出庫聯、客戶聯和回單聯。*聯“存根聯”留存，其它四聯全部交由銷售人員分別送至物流部門及銷售會計，進行組織發貨及銷售臺賬記賬。其中：銷售會計接收一聯（計賬聯），物流部門接收其中的三聯單據（出庫聯、客戶聯及回單聯），即：
第二聯“記賬聯”——銷售會計接收，用于銷售臺賬的記賬及留存。
第三聯“出庫聯”——用于部門內部出庫及留存；
第四聯“客戶聯”——隨貨同行，客戶驗收貨物后簽收留存；
第五聯“回單聯”——隨貨同行，客戶驗收貨物后簽字蓋章，留待業務員回收、記賬后上交營銷中心轉銷售會計上賬后留存；
4. 收單、記錄、上賬
銷售業務人員必須按規定，在60天內將發貨單的“回單聯”從客戶手中回收，回收的“回單聯”必須有客戶的簽收確認（簽名/蓋章）及業務員簽字。若有特殊情況（如回單丟失、金額不符等），則必須由客戶出具相關證明材料，注明金額等詳情，并簽字/蓋章，寄回或由業務員帶回公司，進行審批、上賬。若無客戶的證明材料，則由責任業務員在公司財務留存的“送貨單（記賬聯）”上簽字確認，承擔該批貨物的完整接收責任。
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