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【產品名稱】
通用名稱：經典豬瘟液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒
【規格】96T×2塊
【用途】
檢測豬血清中的經典豬瘟抗體，適用于動物疫苗免疫抗體監測等。
【儲藏與有效期】2～8℃保存，有效期12個月。
【經典豬瘟液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒主要組份】
序號 | 組份名稱 | 數量 |
1 | 抗原包被板 | 96T×2塊 |
2 | HRP-單抗 | 12mL×1瓶 |
3 | 樣品稀釋液 | 20mL×1瓶 |
4 | 陰性對照 | 1.0mL×1管 |
5 | 陽性對照 | 1.0mL×1管 |
6 | 底物AB | 12mL×2瓶 |
7 | 終止液 | 12mL×1瓶 |
8 | 濃縮洗滌液(20×) | 50mL×1瓶 |
9 | 說明書 | 1份 |
【試驗操作】
1、洗滌液配制
將濃縮洗滌液(20×)用蒸餾水或去離子水稀釋成洗滌液(1×)，即1份濃縮洗滌液加入19份蒸餾水，配制的洗滌液(1×)作為洗板用。
2、定性檢測方案(單孔定性，每板檢測92份血清樣本)
【操作步驟】
2.1加樣:設陰性對照血清(A1B1)和陽性血清(C1D1)各2孔，直接加入50ul/孔對照血清；其它為被檢樣品孔，預先在相應孔內加入45ul的稀釋液，接著加入5ul/孔待檢血清；最后，在所有孔內均加入50ul的HRP-單抗，被檢血清即為1：20稀釋。振蕩，混勻，37℃溫育30分鐘。
2.2TMB底物：用洗滌液洗板3遍，最后一次拍干，加入TMB底物，50ul/孔，37℃溫育15分鐘。
2.3反應終止： 加入終止液，50ul/孔，終止反應。
2.4讀值：酶標儀450nm波長讀數。
【計算方法】
2.5阻斷率計算
陰性對照平均值=（OD-A1+OD-B1）/2;
陽性對照平均值=（OD+C1+OD+D1）/2;
樣品阻斷率 PI=[（陰性對照平均值-樣品OD值）/陰性對照平均值]×100%
根據以上公式計算被檢樣品和陽性對照樣品的阻斷率。
2.6試驗成立
兩孔陰性對照OD450nm值至少一孔OD值大于0.5；兩孔陽性對照至少一孔的阻斷率大于60%。
【結果判定】
被檢樣品PI≥50%判為口蹄疫病毒O型抗體陽性；PI＜50%判為口蹄疫病毒O型抗體陰性。
3、定量檢測方案(每板檢測10或20份血清樣本)
在使用前，所有的試劑盒組份應恢復到室溫。試劑應輕輕旋轉或振蕩混勻。每個樣品使用一個單獨的吸頭。
3.1樣品稀釋: 取出抗原包被板，根據不同的需要，選擇圖1或圖2中的一種布局進行操作。圖1為可檢測10份樣品布局圖；圖2為可檢測20份樣品布局圖。每次試驗，每板均需設置陰陽性血清對照及4孔不加血清單抗對照。
以圖1為例操作，A1～A10每孔各加75µL的稀釋液，其它所有孔內各加入50µL的稀釋液。A1～A10每孔各加25µL的待檢樣品，A11孔加50µL的陽性對照，A12孔加50µL的陰性對照，用排槍吹打混勻（每孔吹打3～5次），待檢樣品A1～A10分別以50µL/孔的量從A到H連續2倍稀釋；陽性對照A11以50µL/孔的量從A到H連續2倍稀釋；陰性對照A12以50µL/孔的量從A到B連續2倍稀釋。待檢樣品在第1～10列從1:4稀釋至1:512；陽性對照，從1:2稀釋至1:256，由于試劑盒提供的陽性對照已1:4稀釋，則變為從1:8稀釋至1:1024；陰性對照，從1:2稀釋至1:4。
3.2 加入HRP－單抗：樣品稀釋好后，在所有孔內加入50ul的HRP－單抗，反應體系即為100µL/孔。加樣完畢后，所有稀釋度翻倍，待檢樣品從1:8～1:1024，陽性對照從1:16～1:2048，陰性對照從1:4～1:8，貼封板膜，振蕩混勻。將加好樣的ELISA反應板置于37℃溫育30分鐘。
3.3洗板：用230μL（±20μL）洗滌液(1×)洗滌板孔，共洗滌3次。每次洗滌后應棄去孔內的液體。在最后一次洗滌液棄去后，將孔中殘留的洗滌液拍干。按50μL/孔加入TMB底物，37℃避光溫育10～15min。
3.4讀值： 每孔再加50μL終止液終止反應，立即在450nm波長下讀取OD值。
圖1 96孔板檢測10份樣品布局圖 | ||||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
A | S1 1:8 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 | 1:16 | 1:4 |
B | 1:16 | 1:32 | 1:8 | |||||||||
C | 1:32 | 1:64 | 空白 | |||||||||
D | 1:64 | 1:128 | 空白 | |||||||||
E | 1:128 | 1:256 |
不加血清單抗 對照 | |||||||||
F | 1:256 | 1:512 | ||||||||||
G | 1:512 | 1:1024 | ||||||||||
H | 1:1024 | 1:2048 | ||||||||||
圖2 96孔板檢測20份樣品布局圖 | ||||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
A | S1 1:16 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 | 1:16 | 1:4 |
B | 1:32 | 1:32 | 1:8 | |||||||||
C | 1:64 | 1:64 | 空白 | |||||||||
D | 1:128 | 1:128 | 空白 | |||||||||
E | S11 1:16 | S12 | S13 | S14 | S15 | S16 | S17 | S18 | S19 | S20 | 1:256 |
不加血清單抗 對照 |
F | 1:32 | 1:512 | ||||||||||
G | 1:64 | 1:1024 | ||||||||||
H | 1:128 | 1:2048 | ||||||||||
【結果分析】
3.5試驗成立判斷
不加血清單抗對照OD值應在2.0±1.5范圍內；
陽性對照抗體效價不低于1:1024±1滴度；
陰性對照抗體效價應＜1:8。
3.6結果判定
不加血清單抗對照4孔，棄去最高和OD值，計算剩余2孔的平均OD值，再除以2，即得50%對照值，該值即為臨界值，表示阻斷50％反應的對照OD值。待檢樣品OD值＞臨界值，判為陰性孔；待檢樣品OD值≤臨界值，判為陽性孔。每份待檢樣品系列梯度稀釋中，陽性孔的最高稀釋倍數即為該待檢樣品的抗體效價。若臨界值處于兩個稀釋孔OD值之間，抗體效價取相鄰陽性孔和陰性孔稀釋倍數的反對數中間值。如臨界值處于1:64（反對數值為1.8）與1:128（反對數值為2.1）之間，則判定該份待檢樣品的抗體效價為1:90（反對數值為1.95）。
抗體效價≥64，為疫苗免疫合格。
抗體效價計算對照表（反對數值）
抗體效價 | Log10(效價) 對照計算 | 抗體效價 | Log10(效價) 對照計算 | 抗體效價 | Log10(效價) 對照計算 |
1:4 | 0.6 | 1:32 | 1.5 | 1:256 | 2.4 |
1:6 | 0.75 | 1:45 | 1.65 | 1:360 | 2.55 |
1:8 | 0.9 | 1:64 | 1.8 | 1:512 | 2.7 |
1:11 | 1.05 | 1:90 | 1.95 | 1:720 | 2.85 |
1:16 | 1.2 | 1:128 | 2.1 | 1:1024 | 3 |
1:22 | 1.35 | 1:180 | 2.25 | 1:1440 | 3.15 |
4、注意事項
4.1 為使您的實驗獲得正確結果，請您在實驗前仔細閱讀本說明書。
4.2 所有試劑使用前恢復至室溫(18～26℃)，以免溫度過低影響抗原抗體反應。
4.3實驗前應用溫度計檢查溫箱溫度，溫度過高或過低影響OD值高低。
4.4 包被板反應時嚴禁堆疊放置，應該平鋪且板間有空隙，不要離溫箱壁太近。
4.5實驗所用移液器及設備應定期校準。
4.6采集的樣品要新鮮，并且最好不要溶血。血清標本在2～8℃放置不要超過2天，室溫不超過8小時，如需長時間放置應儲存于-20℃。
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